Une définition

Une modification du matériel biologique

2010-03-26T10:23:47Z

Le génie génétique : origine et intérêt

Le développement des techniques et des connaissances de biologie moléculaire a permis la mise au point d'outils permettant :
- de purifier l'ADN, de déterminer la taille des fragments obtenus (possibilité d'utiliser en routine l'électrophorèse en gel de polyacrylamide ("Polyacrylamide Gel Electrophoresis" - PAGE) et en gel d'agarose à la place de l'ultracentrifugation analytique) ;
- de couper les fragments d'ADN double brin en des sites spécifiques (utilisation des enzymes dits " de restriction") ;
- de lier entre eux des fragments d'ADN (utilisation des ligases) ;
- d'introduire des molécules d'ADN dans une cellule (dite "cellule hôte", cellule d'une espèce pouvant être différente de celle de l'organisme ayant fourni l'ADN), afin d'augmenter la quantité d'ADN (clonage moléculaire) et d'obtenir son expression.

Au début des années 1970, les équipes (américaines) de Paul Berg et de Herbert Boyer (indépendamment) eurent, au même moment, l'idée d'une utilisation rationnelle de ces outils afin de tenter l'expression d'un ADN donné dans une cellule d'origine différente (Berg : expression dans Escherichia coli d'un fragment d'ADN du SV40 inséré dans un phage qui sert à l'introduction dans la cellule hôte ; Boyer : utilisation de plasmides). Ainsi naquit, dans les années 1970, le génie génétique.

Sitôt connue, nombreuses furent les craintes suscitées par cette nouvelle opportunité : les scientifiques en débattirent lors d'une conférence organisée à Asilomar du 24 au 27 février 1975. Les craintes majeures de l'époque se sont dissipées : aucun accident majeur (par exemple, dissémination d'organismes nouveaux doués de propriétés délétères) n'a été enregistré ...

Depuis les débuts, beaucoup de progrès ont été réalisés . Ceux ci concernent :
* les caractéristiques des enzymes utilisés (meilleure activité, spécificité accrue, facilité d'utilisation, ....)
* l'utilisation de caractéristiques fonctionnelles de certains systèmes biologiques : opéron lactose, opéron tryptophane, système Lex Rec, topoisomérase, ...
* la construction d'ensemble de séquences à caractéristiques fonctionnelles précises, optimisées au niveau de leur taille (sites multiples de clonage ("Multiple Cloning Site" ou MCS), "cassettes" d'expression, ....), disponibles au sein de vecteurs (plasmides, phages, phagemides, ...) auprès de sociétés commerciales.

Les techniques de la biologie moléculaire permettent, dans les cas les plus favorables, de déterminer le gène (les gènes) codant pour le produit d'intérêt ou en rapport avec une propriété d'intérêt. Ce gène (chaque gène) peut être extrait, purifié et, en tenant compte de certaines connaissances de biologie moléculaire, modifié.
Il est actuellement possible :
- soit de faire exprimer ce gène modifié (correspondant à un produit d'intérêt plus performant) dans un organisme où l'expression sera plus facile, plus efficace, plus rentable
- soit de le réintroduire dans l'organisme dont il est issu.
Ainsi sont obtenus des organismes génétiquement modifiés (OGMs) Ces OGMs sont, selon les cas, des micro-organismes, des animaux (porcs, chèvres, vaches, ....) ou des végétaux (maïs, riz, pomme de terre, ....).

Il est certain que ces modifications génétiques susceptibles d'être apportées aux êtres vivants ne sont pas sans poser un certain nombre de questions d'ordres scientifique, légal, philosophique, éthique, économique et social. C'est ce dont témoigne le débat actuel, dans certains milieux, sur les OGM.

Un processus qui se veut contrôlé

2010-03-26T10:21:41Z

Contrairement à ce que l'on peut appeler "microbiologie industrielle" dans laquelle on laisait la traznsformation de réaliser sans intervention, les biotechnologies prétendent contrôler le processus.

Ce contrôle est censé s'exercer sur les conditions de culture du microorganisme ou des cellules eucaryotes. Ceci comprend :
      - le choix d'un récipient de taille (de moins d'un litre à quelques centaines de miliers de litres, voir çi-dessus) et de forme adaptée (cylindrique, tubulaire ; fond sphérique ou conique, ..)
      - le choix et le maintien de conditions de culture les plus adaptées :
              * paramètres physiques : température régulée, degré d'homogénéité ;
              * paramètres physico-chimiques : pH et force ionique régulés ;
              * paramètres chimiques : suivi et parfois maintien de la concentration de certains substrats ou métabolites (en particulier, oxygène

Un point particulièrement critique est celui de l'alimentation en substrat : celle ci peut être discontinue (cas du schéma cis-dessus) , semi continue ou continue ....

La mise en oeuvre de ce contrôle nécessite donc des récipients particuliers pour vus de dispositifs d'agitation et de régulation de température, de pH, de concentration en oxygène, ... Pour cela, les cuves utilisées (fermenteurs, bioréacteurs, cytoculteurs, selon le type de matériel biologique servant de (bio)cartalyseur) sont pourvus de dispositifs d'agitation et de capteurs.

De plus l'ensemble de l'installation est sous la dépendance d'odinateurs qui permettent de visualiser les valeurs des divers paramètres et d'en assurer la régulation (possibilité de modofier la valeur des points de consigne en fonction du temps).

Une mise en oeuvre à grande échelle

2010-03-26T10:02:08Z

Une technologie dont tout le monde doit bénéficier ...

Les biotechnologies, comme d'autres technologies dans notre monde moderne, veulent réaliser la production de biens et de services dont chacun peut bénéficier ... Ceci implique que ces biens et services doivent être disponibles en grande quantité, ceci pour des raisons de continuité de la distribution (c'est à dire de disponibilité auprès des consommateurs qui doivent impérativement être fidélisés) et de diminution du pris de revient (et donc, normalement, du prix de vente). Dans le cas de la production de biens (médicaments, produits alimentaires ou autres, ...), il importe donc de transformer, au meilleur coût, de grandes quantités de substrat(s), et ce, le plus rapidement possible ....

La nécessité d'une minimisation des coûts fait privilégier des solutions techniques dans lesquelles on travaille en une seule fois d'importants volumes (le terme "grande échelle" est, le plus souvent, à prendre en terme de "échelle industrielle") et où les installations (bioréacteurs et appareillages en amont et en aval) fonctionnent durant un maximum de temps (l'idéal, du point de vue industriel, étant un fonctionnement sans aucun arrêt, c'est à dire en continu). Les contraintes de la mise en oeuvre à la grande échelle (pour simplifier, les adaptations nécessaires) étaient déjà prises en compte lors d'évolutions, initialement, de la chimie après 1920, avec le génie chimique. Cet aspect "grande échelle" avait pour origine l'art militaire : il s'agissait de la construction d'ouvrages permettant aux armées de franchir des obstacles naturels (comme, par exemple, des rivières). Elle a été étendue dans les années 60 à d'autres domaines (génie mécanique, génie électrique, génie thermique, ...). Ainsi s'est constitué le génie biologique qui regroupe le génie fermentaire, qui s'occupe des aspects particuliers liés à la mise en oeuvre de cultures de microorganismes à grande échelle et le génie enzymatique qui s'occupe de la mise en oeuvre à grande échelle d'enzymes (un exemple est donné, celui de la production d'HFCS). D'aucuns y ont ajouté le génie génétique ...

Une mise en oeuvre de matériel biologique

2010-03-26T10:00:33Z

Molécules et cellules au travail ...

Le matériel biologique peut se trouver sous forme de molécules, d'organites, de fragments cellulaires ou de cellules. Il transforme un ou des substrats en un ou des produits d'intérêt . Il est mis en oeuvre dans des bioréacteurs (terme générique dérivé du vocabulaire du génie chimique désignant des récipients dans lesquels se déroulent une réaction (bio)chimique). Ce terme moderne de bioréacteur peut englober des termes anciens créés pour la mise en oeuvre de divers types de matériel biologique comme fermenteur (terme ancien), cytoculteur (terme plus récent).
Selon le type d'alimentation en substrat du bioréacteur, il faut distinguer :
* les bioréacteurs non alimentés en continu en substrat durant la transformation du ou des susbtrats : le substrat (solide ou liquide) est introduit au début de la réaction, en une seule fois : c'est donc un lot ("batch " en anglais) de substrat qui est traité ; on parle de fonctionnement discontinu ou batch ou de bioréacteur fonctionnant en batch ou de bioréacteur batch ;
* les bioréacteurs alimentés en continu en substrat : le substrat (en solution) est introduit tout au long de la réaction : on parle de fonctionnement continu ou de bioréacteur fonctionnant en continu ; ce type de fonctionnement suppose un alimentation en substrat et un soutirage du milieu (à un même débit, afin que le volume reste constant) ; les avantages d'un tel système sont évidents : la transformation du ou des substrats peut, en théorie, se poursuivre indéfiniment et l'appareillage est utilisé à plein temps (intérêt économique) ; en pratique, ce mode d'alimentation est utilisé durant des périodes plus ou moins longues ; les limitations à un long fonctionnement sont la modification, avec le temps, des caractéristiques du matériel biologique (entres autres : mutation de microorganismes, dénaturation donc inactivation des protéines, ...) et la nécessité de réaliser la maintenance de l'installation ;
* les bioréacteurs partiellement alimentés en : le substrat (en solution) est introduit tout au long de la réaction mais sans qu'il y ait soutirage du milieu : le volume augmente ; on parle de fonctionnement semi-continu ou de bioréacteur fonctionnant en semi-continu ou en batch alimenté ou fed batch ; ce type de fonctionnement suppose un arrêt de la réaction lorsque le volume atteint une certaine valeur (entre autre, risque de débordement ou impossibilité d'assurer une aération correcte, ....)

Les molécules utilisées sont essentiellement des protéines à activité catalytique (enzymes).
- Les enzymes peuvent être utilisés soit solubles (ensemble enzyme substrat en phase homogène), soit insolubilisés (ensemble enzyme (immobilisé) substrat en phase hétérogène) ; d'une manière générale, les enzymes solubles sont plus actifs et moins stables que les enzymes immobilisés ;
- en simplifiant, les enzymes sont utilisés dans des bioréacteurs batch (enzymes solubles) ou des bioréacteurs continus (bioréacteurs à lit fixe ou lit fluidisé) ;
- les exemples classiques d'enzymes utilisés à l'échelle industrielle sont la xylose isomérase (ex glucose isomérase isomérisant le glucose en fructose (isoglucose ou HFCS)), les L amino-acylases (production d'acides aminés), ...

Les exemples de mise en oeuvre d'organites et fragments cellulaires paraissent encore concerner plutôt la recherche et le développement.

Les cellules utilisées sont soit des microorganismes, soit des cellules d'eucaryotes supérieurs. Pour transformer leurs substrats, ces cellules ont besoin de conditions physico chimiques particulières : source de carbone (le plus souvent servant de source d'énergie), d'azote, de phosphore, de soufre et de facteurs de croissance. De plus, les exigences vis à vis de l'oxygène sont variables (sauf pour les anaérobies stricts). La résistance aux forces de cisaillement (liées, par exemple, à la pratique de l'agitation du milieu) est également variable.
- Les microorganismes sont classiquement cultivés dans des fermenteurs ; les possibilités de synthèse sont très importantes (et largement augmentées par l'utilisation du génie génétique) ; les conditions physico-chimiques de développement ne sont pas trop exigeantes mais le maintien d'un niveau d'aération des cultures est souvent un facteur limitant (une culture en croissance a une consommation en oxygène maximale) ; par contre, la rigidité de la paroi bactérienne peut permettre la mise en oeuvre de forces de cisaillement permettant une agitation mécanique importante ; ainsi, a-t-il été possible de mettre en oeuvre des fermenteurs de plus d'un millier de m3 ; à grande échelle, les fermenteurs sont utilisés pour la production de produits associés (éthanol, acide lactique), partiellement (pénicilline) ou non associés (acide citrique) à la croissance ; la mise en oeuvre est encore discontinue mais lors du remplacement des fermenteurs industriels, des fermenteurs discontinus sont remplacés par des fermenteurs continus de plus faible volume (un dizième ?) ; à l'échelle laboratoire, les fermenteurs sont utilisés pour la mise au point de cultures à plus grande échelle ou pour la production de protéines exprimant des séquences clonées dans des cellules hôtes (préparation de protéines de fusion dont les propriétés fonctionnelles et structurales de la partie spécifique seront étudiées car correspondant à une séquence nucléotidique inconnue ou modifiée (mutagénèse dans le cadre de l'ingéniérie des protéines suivie d'une purification du contenu protéique brut obtenu par utilisation de la fixation du tag utilisé sur un support de chromatographie d'interactions biospécifiques) ;
- Les cellules eucaryotes supérieures sont cultivées dans des bioréacteurs particuliers nommés cytocylteurs ; ceux ci sont en général, à grande échelle, plus petits que les fermenteurs (maximum 150 - 200 L) et dotés de systèmes d'agitation spécifiques (agitation douce - hélices marines tournant à faible vitesse - adaptée à des cellules sans parois) dispositifs de contrôle et de régulation plus nombreux et plus sophistiqués dans la mesure où les conditions de culture des cellules sont plus exigeantes : milieux plus riches (glucose) et plus complexes (sérum de veau foetal comme facteur de croissance dont on cherche de plus en plus à se débarrasser pour le contrôle de la culture) ; les cultures sont discontinues ou continues et servent à la production de protéines à usage thérapeutique (anticorps monoclonaux ou protéines devant subir des modification post traductionnelles que seules des cellules eucaryotes supérieures peuvent réaliser).