Evolution ou révolution

Les divers types de matériel biologique utilisé

2010-03-26T10:53:35Z

Les molécules utilisées sont essentiellement des protéines à activité catalytique (enzymes).
    - Les enzymes peuvent être utilisés soit solubles (ensemble enzyme substrat en phase homogène), soit insolubilisés (ensemble enzyme (immobilisé) substrat en phase hétérogène) ; d'une manière générale, les enzymes solubles sont plus actifs et moins stables que les enzymes immobilisés ;
    - en simplifiant, les enzymes sont utilisés dans des bioréacteurs batch (enzymes solubles) ou des bioréacteurs continus (bioréacteurs à lit fixe ou lit fluidisé) ;
    - les exemples classiques d'enzymes utilisés à l'échelle industrielle sont la xylose isomérase (ex glucose isomérase isomérisant le glucose en fructose (isoglucose ou HFCS)), les L amino-acylases (production d'acides aminés), ...

Les exemples de mise en oeuvre d'organites et fragments cellulaires paraissent encore concerner plutôt la recherche et le développement.

Les cellules utilisées sont soit des microorganismes, soit des cellules d'eucaryotes supérieurs. Pour transformer leurs substrats, ces cellules ont besoin de conditions physico chimiques particulières : source de carbone (le plus souvent servant de source d'énergie), d'azote, de phosphore, de soufre et de facteurs de croissance. De plus, les exigences vis à vis de l'oxygène sont variables (sauf pour les anaérobies stricts). La résistance aux forces de cisaillement (liées, par exemple, à la pratique de l'agitation du milieu) est également variable.
- Les microorganismes sont classiquement cultivés dans des fermenteurs ; les possibilités de synthèse sont très importantes (et largement augmentées par l'utilisation du génie génétique) ; les conditions physico-chimiques de développement ne sont pas trop exigeantes mais le maintien d'un niveau d'aération des cultures est souvent un facteur limitant (une culture en croissance a une consommation en oxygène maximale) ; par contre, la rigidité de la paroi bactérienne peut permettre la mise en oeuvre de forces de cisaillement permettant une agitation mécanique importante ; ainsi, a-t-il été possible de mettre en oeuvre des fermenteurs de plus d'un millier de m³ ; à grande échelle, les fermenteurs sont utilisés pour la production de produits associés (éthanol, acide lactique), partiellement (pénicilline) ou non associés (acide citrique) à la croissance ; la mise en oeuvre est encore discontinue mais lors du remplacement des fermenteurs industriels, des fermenteurs discontinus sont remplacés par des fermenteurs continus de plus faible volume (un dizième ?) ; à l'échelle laboratoire, les fermenteurs sont utilisés pour la mise au point de cultures à plus grande échelle ou pour la production de protéines exprimant des séquences clonées dans des cellules hôtes (préparation de protéines de fusion dont les propriétés fonctionnelles et structurales de la partie spécifique seront étudiées car correspondant à une séquence nucléotidique inconnue ou modifiée (mutagénèse dans le cadre de l'ingéniérie des protéines suivie d'une purification du contenu protéique brut obtenu par utilisation de la fixation du tag utilisé sur un support de chromatographie d'interactions biospécifiques) ;
- Les cellules eucaryotes supérieures sont cultivées dans des bioréacteurs particuliers nommés cytocylteurs ; ceux ci sont en général, à grande échelle, plus petits que les fermenteurs (maximum 150 - 200 L) et dotés de systèmes d'agitation spécifiques (agitation douce - hélices marines tournant à faible vitesse - adaptée à des cellules sans parois) dispositifs de contrôle et de régulation plus nombreux et plus sophistiqués dans la mesure où les conditions de culture des cellules sont plus exigeantes : milieux plus riches (glucose) et plus complexes (sérum de veau foetal comme facteur de croissance dont on cherche de plus en plus à se débarrasser pour le contrôle de la culture) ; les cultures sont discontinues ou continues et servent à la production de protéines à usage thérapeutique (anticorps monoclonaux ou protéines devant subir des modification post traductionnelles que seules des cellules eucaryotes sont capables de réaliser).

Des conditions de culture bien spécifiques

2010-03-26T10:51:20Z

L'utilisation de matériel biologique a commencé par une culture de bactéries, de champignons ou de moisissures de surface en milieu solide ou liquide. Cette culture a été longtemps empirique.

La culture submergée en milieu liquide, actuellement la plus répandue et la plus classique dans un contexte scientifique, est relativement récente même si diverses tentatives plus ou moins réussies ont été réalisées. La plus célèbre est peut être celle de Weizman durant la première guerre mondiale : il réussit à faire produire par un Clostridium (donc en anaérobiose stricte) de l'acétone et du butanol utilisés pour la fabrication d'explosifs (dynamite, par exemple obtenue par évaporation de l'acétone qui a servi de solvant à la nitroglycérine pour la mise en contact avec un support la stabilisant : la terre de diatomées ou Kieselguhr). Une production d'acide lactique était également réalisée ... en plus de ce qui était réalisé en brasserie.
Si, après les travaux de Pasteur et de Koch définissant la notion et les conditions d'obtention de cultures pures, des cultures pures étaient utilisées comme inoculum, le suivi des conditions de culture restait essentiellement empirique: Il s'agissait des débuts de la microbiologie industrielle.

La culture en milieu liquide a été étudiée, pour la première fois au laboratoire, par Jacques Monod (1910 - 1976) dans sa thèse soutenue en 1942 consacrée à Bacillus coli (qui deviendra Escherichia coli en 1954) ; outre la définition de conditions expérimentales de culture précise permettant l'obtention de résultats reproductibles, ce chercheur définit les paramètres de croissance (taux de croissance, rendement de transformation d'un substrat en biomasse ou en un produit, ....) et le phénomène de diauxie (ce qui conduira l'équipe de l'Institut Pasteur à la découverte de la notion d'opéron - l'opéron lactose, en l'occurence et le prix Nobel de 1965

La culture submergée à l'échelle industrielle a été réalisée, pour la première fois, aux USA (industrie pharmaceutique en rapport avec un centre de recherche fédéral) durant la seconde guerre mondiale pour la production de pénicilline, premier antibiotique dont les pouvoirs thérapeutiques ont été mis en évidence (par Florey et Chain vers 1941). Ainsi naquit, dans l'immédiat après guerre, l'importante industrie des antibiotiques.

Furent alors rapidement mises en évidence les particularités liées à une culture de microorganismes à grande échelle : nécessité d'utiliser des cuves en acier inoxydable de forme bien précise (fermenteur de type Porton) , nécessité du maintien de la stérilité, importance de l'aération .... Au fur et à mesure du temps furent mis en évidence la nécessité du contrôle de paramètres comme le volume du fermenteur, la température, le pH, l'aération. De plus, il fut reconnu que les performances de la culture étaient nettement améliorées si des paramètres comme pH, température, taux d'oxygène étaient maintenus constants, c'est à dire régulés par ajout de réactifs en quantité déterminée (classiquement de base comme KOH, ou de NH₃ dans le cas de la régulation du pH).
De grands progrès techniques ont été réalisés (électrode à oxygène - électrode de Clark en 1948, généralisation de l'usage des électrodes de verre, généralisation de la régulation PID, ....) depuis les débuts de la production de pénicilline : les paramètres de fermentation peuvent être maintenant suivis en ligne (en temps réel) et la régulation de paramètres comme pH, température, concentration d'oxygène dissous est maintenant réalisée dans les appareillages récents quelle qu'en soit l'échelle.

Des études ont ainsi pu être menées permettant de déterminer des relations entre des paramètres physico chimiques mesurés et des grandeurs caractérisant l'état de la culture. Ces relations permettent de prédire , dans des limites données, le comportement de la culture. En tenant compte du mode d'alimentation en substrat, et en utilisant les relations précédentes, il est possible de prédire l'évolution de la biomasse, des substrats et des produis en fonction du temps, c'est à dire de modéliser la fermentation.
De même; on peut également tenter prédire le fonctionnement métabolique des cellules en fonction des concentrations des divers substrats disponibles. Ainsi peut-on avoir des modèles globaux du comportement du micoorganisme durant la fermentation.
Ces modèles peuvent servir de guide pour le suivi d'une fermentation et son pilotage en cas de déviation du comportement normal.

On voit que le temps n'est plus à la non intervention au cours de la culture : grâce à la théorisation de la fermentation, aux outils permettant la mesure en ligne des paramètres, il est possible non seulement de suivre de manière (plus ou moins précise) le déroulement de la culture et même, dans les cas les plus favorables; de l'orienter.

Un nouvel outil : le bioréacteur

2010-03-26T10:47:46Z

Le matériel biologique peut se trouver sous forme de molécules, d'organites, de fragments cellulaires ou de cellules. Il transforme un ou des substrats en un ou des produits d'intérêt . Il est mis en œuvre dans des bioréacteurs (terme générique dérivé du vocabulaire du génie chimique désignant des récipients dans lesquels se déroulent une réaction (bio)chimique). Ce terme moderne de bioréacteur peut englober des termes anciens créés pour la mise en œuvre de divers types de matériel biologique comme fermenteur (terme ancien), cytoculteur (terme plus récent).

Selon le type d'alimentation en substrat du bioréacteur, il faut distinguer :
         * les bioréacteurs non alimentés en continu en substrat durant la transformation du ou des substrats : le substrat (solide ou liquide) est introduit au début de la réaction, en une seule fois : c'est donc un lot ("batch " en anglais) de substrat qui est traité ; on parle de fonctionnement discontinu ou batch ou de bioréacteur fonctionnant en batch ou de bioréacteur batch ;
         * les bioréacteurs alimentés en continu en substrat : le substrat (en solution) est introduit tout au long de la réaction : on parle de fonctionnement continu ou de bioréacteur fonctionnant en continu ; ce type de fonctionnement suppose un alimentation en substrat et un soutirage du milieu (à un même débit, afin que le volume reste constant) ; les avantages d'un tel système sont évidents : la transformation du ou des substrats peut, en théorie, se poursuivre indéfiniment et l'appareillage est utilisé à plein temps (intérêt économique) ; en pratique, ce mode d'alimentation est utilisé durant des périodes plus ou moins longues ; les limitations à un long fonctionnement sont la modification, avec le temps, des caractéristiques du matériel biologique (entres autres : mutation de microorganismes, dénaturation donc inactivation des protéines, ...) et la nécessité de réaliser la maintenance de l'installation ;
         * les bioréacteurs partiellement alimentés en substrat (en solution) est introduit tout au long de la réaction mais sans qu'il y ait soutirage du milieu : le volume augmente ; on parle de fonctionnement semi-continu ou de bioréacteur fonctionnant en semi-continu ou en batch alimenté ou fed batch ; ce type de fonctionnement suppose un arrêt de la réaction lorsque le volume atteint une certaine valeur (entre autre, risque de débordement ou impossibilité d'assurer une aération correcte, ....)

Introduction

2010-03-26T10:46:18Z

La possibilité de cette mise en application dans des conditions économiquement acceptables est liée aux aspects techniques, à la possibilité ou non de résoudre certains problèmes techniques, d'améliorer le rendement du procédé, ceci permettant de diminuer le prix de revient .... C'est dire le rôle particulièrement important joué par l'évolution technique, l'innovation technique. Certaines d'entre elles méritent le nom de "révolutions technologiques".... La technologie doit être considérée en relation avec la rentabilité des opérations réalisées : la rentabilité est la condition sine qua non de toute activité industrielle durable.

Certes, au laboratoire, on met en oeuvre un certain nombre de techniques, mais celles ci sont des "techniques de laboratoire", c'est à dire mises en oeuvre sur de faibles volumes : on travaille à l'échelle laboratoire. Ces techniques à l'échelle laboratoire sont le plus souvent incomptables avec une utilisation sur de grands volumes (échelle industrielle). Les manipulations seraient trop nombreuses, c'est à dire trop coûteuses en personnel. Il faudra donc soit adapter la technique pour la rendre économiquement praticable en grands volumes soit passer à d'autres techniques.
La recherche de telles solutions constitue le développement. du procédé. Dans les entreprises industrielles, il est souvent associé à la recherche : on parle souvent de "Recherche et Développement, R D").

Ce développement industriel s'est avéré particulièrement important en ce qui concerne les conditions d'utilisation du matériel biologique (enzymes, cellules, organismes vivants) : il doit être mis en oeuvre dans des conditions physico-chimiques compatibles avec son activité et sa survie (domaine d'acidité , présence de sels minéraux et température dans certaines limites, ....).

	Activité des enzymes et des cellules (durée limitée)	Culture des cellules (survie sur une longue période)
Acidité du milieu	Valeur déterminée	Dans certaines limites
Sels minéraux	Nature et quantité déterminées ; certains ions inhibiteurs	Dans certaines limites de concentration ; certains ions toxiques
Nutriments		Présence de substrats énergétiques (sucres ou autres) Autres substrats (oxygène)

Des solutions techniques adaptées de ce qui était réalisé en chimie industrielle ont été progressivement mises au point. Elles permettent, par exemple, la réalisation de cultures en grand volume, reproductibles, de micro-organismes ou de cellules eucaryotes naturels ou recombinants .... Lors de celles-ci, les paramètres de culture sont de plus en plus souvent régulés : sont largement utilisés les automatismes et l'informatique.

Ainsi, comme tout procédé industriel, la mise au point d'un procédé (de production) biotechnologique passe par trois phases correspondant à trois "échelles", chacune correspondant à un type d'activités :

*Echelle*	*Activité*	Exemples
Laboratoire	Recherche	1 - Sélection ou obtention par génie génétique d'un micro-organisme adapté à une certaine production d'intérêt commercial (acide aminé) et définition des conditions expérimentales (conditions physico-chimiques de culture) en faible volume 2 - Obtention d'un enzyme transformant un substrat en un produit d'intérêt commercial (acide aminé) et définition des conditions expérimentales d'utilisation en bioréacteur de faible volume
Pilote	Développement	1 - Définition des conditions expérimentales (forme et taille du fermenteur, conditions physico-chimiques de culture) physico-chimiques de culture en grand volume 2 - Définition des conditions expérimentales d'utilisation en bioréacteur de grand volume 3 - Respect des conditions de sécurité et de la législation en vigueur
Industrielle	Production	1 - Obtention en grande quantité dans les meilleures conditions de rentabilité possible 2 - Standardisation et mise sous forme commerciale 3 - Respect des conditions de sécurité et de la législation en vigueur

A chacune de ces phases doivent être résolus divers problèmes techniques.