Histoire de la biochimie

Tiselius

2010-04-28T19:23:13Z

Lily E. Kay
Hist. Phil. Life Sci., 10 (1988), 51 - 72
Laboratory Technology and biological knowledge
The TISELIUS Elecrophoresis Apparatus, 1930-1945

(traduction des 3 premières pages)

Introduction

En 1937, Les "Transactions of the Faraday Society" annonçaient (la mise au point d’)un nouvel appareil pour l'analyse électrophorétique des mélanges colloïdaux, par Arne TISELIUS de l'Université d'Uppsala ([1]). C'était une énorme pièce d'équipement, prenant 20 pieds (609,60 cm soit 6,096 m) en longueur et environ 5 pieds (1,524 m) en hauteur (1 pied = 30,48 cm). Il utilisait un tube en U en verre spécialement fabriqué, dans lequel les mélanges de protéines sujets à une force électromotrice étaient pour la première fois séparés de manière satisfaisante par la différence de charge, et les frontières qui se déplacent étaient visualisées par un dispositif Schlieren, ou par « shadow photography ». Il coûtait 6000 $ à construire et 5000 $ par an pour la maintenance et la mise en œuvre (ceci incluant les salaires d'un physicien et d'un couple de techniciens spécialement formés), un coût approchant celui de la construction (page 52) et du fonctionnement du cyclotron qui était son contemporain ([2]). Ce nouvel outil eut un fort impact sur la recherche dans les sciences de la vie et devint le centre de l'organisation de projets interdisciplinaires en biochimie, en microbiologie, en immunologie et en génétique biochimique ; c'était un outil de première importance dans le champ naissant de la biologie moléculaire[3]. Les études d'électrophorèse allaient se trouver au premier plan des études de biochimie et de biologie moléculaire dans les années 1940, amenant à quelques découvertes significatives, par exemple, l'isolement des anticorps, le fractionnement du sang et l'élucidation des bases moléculaires de l'anémie falciforme. En reconnaissance de son importante contribution aux connaissances biologiques, TISELIUS fut récompensé en 1948 par le prix Nobel de Chimie.
page 52 : L'introduction de l'appareil d'électrophorèse de TISELIUS dans les sciences de la vie était un reflet d'une tendance croissante. Entre les années 1930 et 1950, divers domaines des sciences de la vie évoluèrent en entreprise scientifique sophistiquée et coûteuse. Les laboratoires de biologie et de biochimie, précédemment essentiellement caractérisés par de la verrerie, des microscopes et des instruments de paillasse relativement simples, vers le milieu du siècle en vinrent à utiliser de puissantes machines comme des ultracentrifugeuses, des microscopes électroniques et des appareils à électrophorèse. En fait, une caractéristique marquante de la nouvelle biologie moléculaire, qui était financée et soutenue par la Rockefeller Foundation dans les années 1930 et 1940, était une application délibérée et systématique d'outils provenant des sciences des sciences physiques pour l'étude des processus vitaux ([4]).
page 52 : Cet accent mis sur la technologie transforma, d'une manière croissante, la recherche biologique dans divers domaines en "big science" - une activité d'équipe centrée sur des appareils massifs. Ceci, à son tour, eut un profond impact sur l'organisation de la recherche. L'escalade des coûts de l'équipement de laboratoire créèrent le besoin d'un financement à grande échelle des sciences de la vie par le secteur privé, spécialement la Rockefeller Foundation. Des projets d'équipe tournant autour de nouvelles technologies complexes amenèrent la création de réseaux de spécialistes - ou de "groupes de paradigmes" selon la terminologie de KÜHN - qui partageaient non seulement les matériels et les méthodes mais aussi les prémices et les vues scientifiques du monde ([5]). A l'intérieur d'une telle vue du monde, la connaissance biologique croissante quitta (page 53) l'étude des organismes supérieurs et fut repensée en terme d'investigation cellulaire et moléculaire, spécialement de recherche sur les protéines ; les résultats obtenus grâce à ces outils qui sondèrent les cellules et molécules furent interprétés en langage physico-chimique.
page 53 : L'appareil d'électrophorèse selon TISELIUS et les recherches qu'il initia sont un exemple de ces progrès scientifiques et institutionnels dans les sciences de la vie. D'un point de vue intellectuel, la conception et les premières utilisations reflétaient la prémisse centrale que les protéines étaient les substances physiologiques primaires. La plupart des chercheurs en science de la vie supposaient implicitement que la spécificité des anticorps, des enzymes, des virus et des gènes était déterminée par leur composition en protéines : il était alors considéré comme assuré qu'en élucidant les propriétés physico-chimiques des protéines on pourrait rendre compte des myriades de phénomènes impliqués dans la croissance, la régulation et la réplication, et d'une manière ultime de révéler la nature véridique de la vie elle même ([6]).
page 53 : Du point de vue institutionnel, la recherche sur l'électrophorèse signifiait l'accès à des ressources. Jusqu'à la fin des années 1940, quand il commença à être disponible commercialement, plus facile d'utilisation et moins cher, l'appareil de TISELIUS était la marque de laboratoires bien dotés. A leur tour, les laboratoires de ces chimistes des protéines, entièrement ou en partie subventionnés par des fonds fournis par la Rockefeller Foundation devinrent des centres de formation spécialisée et des sites de projets de collaboration en électrophorèse dans les sciences de la vie ([7]).
page 53 : L'émergence et la première diffusion de l'appareil d'électrophorèse selon TISELIUS peut alors servir à une intéressante étude de cas sur la naissance de la recherche basée sur la technologie dans les sciences de la vie dans les années 1930 et 1940. Des débuts de la conception et de la construction à la diffusion plus tardive et à l'utilisation de l'appareil de TISELIUS, on peut observer l'influence des progrès intellectuels et institutionnels déjà mentionnées : l'accent mis sur l'approche physico-chimique des phénomènes biologiques, la (page 54) domination du paradigme des protéines, l'émergence d'un réseau de spécialistes et le rôle central de la Rockefeller Foundation dans le développement des sciences de la vie. Au même moment, l'étude de cas concernant l'appareil de TISELIUS met en lumière l'impact des outils expérimentaux sur la connaissance biologique et l'importance d'étudier le rôle que joue la technologie de laboratoire dans l'histoire des sciences de la vie.

Electrophorèse et recherche sur les protéines 1930 - 1937

page 54 : Quand TISELIUS vint à l'Université de Princeton comme boursier Rockefeller, en 1934, il avait mis au point le projet compliqué d'électrophorèse, sa thèse à l'Université d'Uppsala sous la direction de The SVEDBERG, l'inventeur de l'ultracentrifugeuse ([8]). "Je peux encore me souvenir de cela comme presque d'une souffrance physique quand regardant des photos d'électrophorèse, principalement des protéines sériques", se souvenait TISELIUS, des années après, "je décidais de m'intéresser au problème d'une manière toute différente, mais une cicatrice était déposée dans mon esprit et ceci s'avéra des années plus tard significatif ([9]).. Pendant cette année de bourse Rockefeller durant laquelle il avait prévu d'étudier les cristaux (page 55) de zéolithes, TISELIUS, fortement pressé par les collègues et les amis de SVEDBERG au Rockefeller Institute décida de réduire ses efforts. Il décida de retourner au problème irrésolu de la séparation des protéines et son obstacle majeur pour expliquer les mécanismes moléculaires gouvernant les phénomènes vitaux.
page 55 : L'urgence pour le groupe d'Uppsala et les chercheurs de l'Institut Rockefeller de développer une technologie pour séparer les protéines et le soutien prodigue de la Rockefeller Foundation pour la recherche sur les protéines reflétaient les prémisses que les protéines étaient les déterminants de la spécificité biologique et de la base physique de la vie. "Toute cette association de phénomènes que nous appelons "vie" est manifestée uniquement par de la matière constituée de grandes quantités de protéines, et n'est jamais montrée en l'absence de telles substances". Ceci était une citation d'un des plus importants textes de biochimie que Warren WEAVER (le Directeur de la Division des sciences Naturelles de la Rockefeller Foundation) utilisait pour justifier la jonction croissante de fonds dans la recherche sur les protéines , fonds qui furent également utilisés pour la construction de l'appareil à électrophorèse de TISELIUS et pour la recherche qu'il engendrait ([10]).
page 55 : Faisant écho aux vues des leaders dans différents domaines de la biochimie et de la physiologie, WEAVER expliquait la position centrale de la recherche sur les protéines dans le programme de la Rockefeller Foundation en biologie moléculaire :

"Les protéines sont les constituants fondamentaux des muscles, des tendons et des tissus de connexion ; ils ont une partie d'à peu près chaque organe et interviennent dans à peu près tous les processus vitaux. Elles sont le composant principal des chromosomes qui gouvernent notre hérédité ; ce sont les éléments de base du protoplasme de toute cellule de chaque chose vivante. Notre immunité vis à vis de beaucoup de maladies dépend de la mystérieuse capacité des globulines sériques, une protéine dans le flot sanguin pour former des anticorps spécifiques quand des protéines étrangères sont introduites. Plusieurs hormones sont de nature protéique."

page 55 : Il se mit à faire la liste des nombreuses maladies causées par les virus - "des molécules de grosses (longe) protéines" - et à décrire les activités des enzymes : "les exécutants parfaits". A cause de ces propriétés, WEAVER concluait, les protéines méritaient leur nom de "substance première" et étaient par conséquent un objectif premier pour des recherches physiologiques ([11]).
page 55 : WEAVER signala qu’en dépit de l'importance des protéines, la connaissance de leur structure, leurs propriétés physico-chimiques et leur compréhension des mécanismes gouvernant leurs spécificités biologiques étaient vagues. Cependant dans les débuts de 1930, il y avait à peine (hardly) un domaine des sciences de la vie où (page 56) la séparation des protéines individuelles d'un mélange complexe n'était pas un obstacle majeur. Par exemple, il était bien connu d'après les recherches de Karl LANDSTEINER et autres que le sérum sanguin était un complexe qui pouvait être séparé en fractions, mais les scientifiques soupçonnaient que quelques unes des fractions séparées étaient en fait des artefacts expérimentaux, produits par des extraction

[1] Ref 1 : A. TISELIUS, A New Apparatus for Electrophretic Analysis of Colloidal Mixtures, Transactions of the Faraday Society, 33, 1 (1937), 524 - 531
[2] Ref 2 : Rockefeller Archive Center
[3] Note du traducteur : il s’agit dans cet article de ce qui peut être appelé la « première » biologie moléculaire : l’explication des phénomènes biologiques en utilisant le concept de molécules ; la biologie moléculaire des années 70, centrée sur la transmission de l’information génétique, est, de ce point de vue, chronologiquement seconde et ne concerne, sensu stricto, que certains aspects des phénomènes biologiques .
[4] Ref 3 : Pour différents aspects du rôle de la Rockefeller Foundation dans la mise en forme de la biologie moléculaire et son modus operandi voir : R. A. Kohler, The management of Science : The experience of Warren Weawer and the Rockefeller Foundation Programme in Molecular Biology, Minerva, 14, 1976, 249 - 293 ; E. J. Yoxen, Giving Life a New Meaning : The Rise of Molecular Biology Establishment, Scientific Establishments and Hierarchies: Sociologies of Sciences, V, edited by N. Elias, H. Martins and R. Whitly, Dordrecht, D. Reidel, 1982, 123 - 143 ; P. Abir-Am, The Discourse of Physical Power and Biological Knowledge in the 1930s : A Reappraisal of the Rockefeller Foundation's "Policy" in Molecular Biology, Social Studies of Science, 12, 1982, 341 - 382 ; and L. E. Kay, Conceptual Models and Analytical Tools : The Biology of the Physicist Max Delbrück, Journal of History of Biology, 18, N° 2, 1985, 207 - 246
[5] Ref 4 : T. S. Kuhn dans sa discussion des caractéristiques de la science normale dans The Sruture of Scientific revolution, Chicago, University of Chicago Press, 1962, Chapitrs 3 et 4, a déjà attiré l'attention sur le rôle important des méthodes et instruments dans l'identification des groupes de paradigmes. Derek da Solla Price fut celui qui mit le plus en lumière (principal proponent) l'idée que des "colleges invisibles" ou de réseaux scientifiques façonnaient les disciplines scientifiques, par l'accès à des appareils ou des publications. Voir par exemple, D. de S. Price et D. Beaver, Collaboration in an invisible College, in American Psychologist, 21, 1966, 1011 - 1018
[6] Ref 5 : Des affirmations (statements) concernant la primauté des protéines dans les sciences biologiques se rencontrent dans beaucoup d'endroits dans la littérature scientifique durant lapremière moitié de ce siècle, par exmple le Journal of General Physiology, Protoplasm et Scientific American. pour une discussion de' ce point voir également L. E. Kay, Cooperative Individualism and the Growth of Molecular Biology at the California Institute of technology, 1928 - 1953, Ph D Dissertation, The Johns Hopkins University, 1986
[7] Ref 6 : En plus de la Rockefeller Foundation, le Josiah Macy Jr. Foundation à New York finançait la construction d'appareils de TISELIUS dans les années 1940, et en Suède, les fondations Nobel et Wallenberg
[8] Ref 7 : A. TISELIUS, The Moving Boundary method of Studying the Electrophoresis of Proteins, Inaugural Dissertation Uppsala, 1930 ; Nova Acta Soc. Scient. Upsaliensis, IV, 7, N° 4 Voir également The Svedberg, Trans. Faraday Soc., 26, 1930, 737
[9] Ref 8 : R. A. Kekwick et K. O. Pedersen, Arne TISELIUS, in Biographical Memoirs of Fellows of the Royal Society, 20, 1974, 403. Egalement TISELIUS , in Dictionnary of Scientific Biography, 3, New York, Scribers, 1970 - 1980, 420
[10] Ref : citation d'après Warren WEAVER de Fundamentals of Biochemistry, 1935, p. 1
[11] ref 10 : Warren WEAVER (note 9) pages 4 - 5

Svedberg et Tiselius 1

2010-04-17T09:50:37Z

The Svedberg et Arne Tiselius :
Les premiers développements de la chimie moderne des protéines à Uppsala

par Kai O. Pedersen

Comprehensive Biochemistry, vol 35, Elsevier, 1983, 233 - 281

(Version partielle, sans références ; partie 1)

Page 233 - Aujourd'hui les protéines solubles sont considérées comme des macromolécules bien définies. L'étudiant d'aujourd'hui prend comme assuré que les protéines ont une composition chimique et structurale bien définies ainsi qu’une masse moléculaire bien spécifiques.
Page 233 - Dans les années vingt, quand j'étudiais la chimie à l’Université de Copenhague , la situation était sensiblement différente. Les protéines solubles étaient généralement regardées comme des colloïdes lipophiles qui formaient des micelles de tailles variables. On connaissait peu de choses sur la composition chimique et sur la structure des protéines. Les travaux d’Emile Fischer (1852 - 1919) et de Franz Hofmeister (1850 - 1922) au début du siècle ont montré que les protéines contenaient des acides aminés variés liés ensemble par des liaisons peptidiques. A l'état dissous, elles donnent des solutions colloïdales indiquant un poids des particules vraiment élevé, au moins plusieurs centaines de grammes par mole, peut être plus important que 10000.
Page 233 - Les particules colloïdales n'étaient pas considérées comme de vrais composés chimiques mais plutôt comme des agrégats plus ou moins (formés) au hasard. Les chimistes des colloïdes d'alors pensaient donc que c'était une perte de temps que d'étudier les propriétés des protéines comme si ces substances étaient des individualités chimiques véritables. Même si le point de vue « colloïde » était généralement admis au début du siècle, il ne le fut jamais universellement et il y eut toujours quelques chimistes des protéines pour faire des recherches sur les protéines dans la même direction que celle d'aujourd'hui[1].
Page 233 - A cette époque, beaucoup de protéines avaient été préparées principalement par précipitation par les sels ou par une autre méthode de précipitation. Cependant, dans la mesure où le matériel de départ contenait un mélange de différentes protéines avec d'autres substances chimiques, la composition des protéines (page 234) obtenues par précipitation par les sels variait avec les conditions expérimentales. Pour améliorer la pureté des protéines, celles-çi étaient souvent précipitées un certain nombre de fois pour enlever le matériel étranger et avec l'espoir d'obtenir une protéine pure. Cependant le grand problème, c'était qu'il n'existait aucun critère sûr de pureté des protéines. Elles étaient caractérisées essentiellement par leur origine, leur solubilité, leur pouvoir rotatoire et leur composition élémentaire. Dans peu de cas, une composition approximative en acides aminés avait été déterminée après une travail de plusieurs mois.
Page 234 - Quelques protéines, comme l'hémoglobine et les globulines des graines, avaient pu être cristallisées et former des cristaux bien définis dont la forme variait avec l’origine de la protéine, ceci pour la plupart des protéines similaires provenant d’espèces proches. Au début du siècle quelques scientifiques américains avaient montré que, pour le spécialiste, il était cependant possible de distinguer une espèce d'un certain genre d'une autre espèce du même genre en comparant leurs cristaux d'hémoglobine[2]. Ces résultats pourraient avoir montré que les protéines étaient des molécules très bien définies. Mais les chimistes des colloïdes à cette époque ne semblaient pas avoir pris en compte ces résultats, ou les avaient négligés.
Page 234 - Pendant la première guerre mondiale, SPL Soerensen et ses collaborateurs au Laboratoire Carlsberg de Copenhague étudièrent la pression osmotique de diverses solutions d'albumine d'oeuf. Ils en arrivèrent à la conclusion que le poids de la molécule moyenne la plus simple de protéine était d'environ 34000. Ce résultat fut publié en 1917[3]. 30 ans plus tard, Güntelberg et Linderström-Lang [4] du même laboratoire, firent une étude critique de ces anciens résultats et ils trouvèrent qu’une masse moléculaire d'environ 45000 correspondrait mieux aux anciens résultats que les 34000 choisis en 1917. A ce moment,

( … )

The Svedberg

Page 235 - The (Theodor) Svedberg était né le 30 Août 1884 à Fleräng dans la paroisse de Valbo près de Gävle, Suède. Il était le fils unique de Elias Svedberg et Augusta Alstermark. Son père était directeur de différentes entreprises sidérurgiques en Suède et en Norvège, et la famille a vécu dans divers endroits de Scandinavie. Depuis sa jeunesse, Svedberg avait été profondément intéressé par la chimie, la physique et la botanique. Il passa les années 1900 - 1903 dans une école primaire renommée à Örebro. Là il eut des maîtres compréhensifs qui l'autorisèrent à étudier par lui même dans les laboratoires de physique et de chimie de l'école les après midis après les leçons ordinaires.
Page 235 - En janvier 1904, Svedberg s'inscrit à l'Université d'Uppsala. Avant de quitter sa maison, il ne savait pas s'il allait étudier la biologie, spécialement la botanique, qui sera un de ses grands intérêts au cours de sa vie, ou la chimie, son autre grand centre d'intérêt. Finalement il décida d'étudier la chimie espérant que beaucoup de problèmes en biologie trouveraient tôt ou tard leurs explications en tant que phénomènes chimiques.
Page 235 - Svedberg étudia d'une manière intensive et, en un temps record, il suivit les cours nécessaires, passa les examens et obtint son Fil. kand (B.Sc) en septembre 1905. Il se sentait maintenant prêt à commencer la recherche proprement dit. Durant son temps libre, il avait lu (en 1903) l'édition de 1903 de la Theoretische Chemie de Nernst, et il avait été (page 236 photo de Svedberg - page 237) particulièrement intéressé par la partie touchant aux colloïdes. Dans une des librairies d'Uppsala, il trouva Zur Erkenntnis der Kolloide de Zsigmondy. Après avoir lu ce livre et le Anorganische Fermente de Bredig, il commença à préparer des organosols de divers métaux par modification de la méthode de Bredig. Sa première publication se fit en 1905[5]. Dans les mois suivants, il étudia en détail la manière de les obtenir et, dans une seconde publication[6], il décrivit les organosols de plus de 30 métaux, certaines d'entre elles étant stables, d'autres (moins) stables, seulement un jour ou moins. (17 November, 1993) Maintenant il savait comment préparer nombre d’organosols stables de métaux selon une manière reproductible, et il pouvait commencer des études quantitatives des propriétés physico-chimiques de ces solutions colloïdales de métaux, spécialement de leur taille, l'un de ses intérêts essentiels pour les 15 années suivantes.
Page 237 - En 1904, les chimistes d'Uppsala emménagèrent dans un institut nouvellement construit. Cependant, les possibilités expérimentales étaient très limitées et primitives. Quelques pièces avaient été réservées pour la chimie physique bien que l'équipement ait fait défaut ou doive être construit par les étudiants eux mêmes. Avec Carl Benedicks (1875 - 1958) , qui était un nouveau "docent" (assistant professeur) en chimie physique, Svedberg réussit à obtenir les éléments nécessaires à la construction d’un ultramicroscope selon Zsigmondy -Siedentopf. Avec cet instrument, Svedberg pouvait étudier les mouvements browniens des particules dans les organosols de métaux Il était capable d'interpréter ces résultats expérimentaux par les nouvelles théories d'Einstein (1879 - 1955)[7] [8] et de von Smoluchowksi (1872 - 1917) [9].

( … )

La centrifugeuse optique

Page 239 - Au printemps 1923, ils construisirent une centrifugeuse dans laquelle la sédimentation pouvait être suivie de manière optique pendant que la centrifugation se déroulait[10] . Dans cette centrifugeuse, ils étudièrent la sédimentation de diverses sols de métaux et de quelques autres solutions (organosols) colloïdales et ils comparèrent les résultats avec les mesures ultramicroscopiques des mêmes solutions. Les expériences furent prometteuses. Cependant, comme, la centrifugeuse avait des cellules cylindriques et non en forme de secteurs, les particules étaient partiellement entraînées vers le bas par convection le long des parois de la cellule.
Page 239 - Il y a des indices (laissant à penser que) Svedberg s'intéressait réellement, à ce moment, à la détermination de la taille des particules telles que des protéines. Dans une conférence sur les colloïdes en 1923 à Madison, il dit :

"Il est possible de mettre au point une méthode pour enregistrer les courbes de distribution lors de l'observation de la diffusion".

et un peu plus tard :

"Des expériences de cette sorte sont prévues dans mon laboratoire. Elles sont importantes parce que nous avons affaire à un des moyens peu nombreux d’étudier la distribution de tailles dans les sols de protéines[11]."

Page 239 - En tant que chimiste des colloïdes, il était convaincu que les protéines étaient des colloïdes lipophiles et que les particules dans les sols de protéines avaient des tailles variables.
Page 239 - Sur le chemin du retour en bateau sur l'Atlantique, il fit des ("sketches" = dessin à grands traits) esquisses pour des rotors de centrifugeuses futures. Une chose essentielle était qu'elles devaient avoir une forme de secteur.
Page 239 - De retour à Uppsala, Rinde et lui même travaillèrent à l'automne à la construction de nouvelles centrifugeuses. Une feuille de papier avec une vague esquisse d’une centrifugeuse, datée du 23 novembre 1923, est notée "analyse centrifuge des protéines». Cependant leur premier objectif fut de construire une centrifugeuse qui puisse être utilisée pour l'étude de la sédimentation de sols de métaux.

Svedberg et Tiselius 2

2010-04-17T09:50:37Z

The Svedberg et Arne Tiselius :
Les premiers développements de la chimie moderne des protéines à Uppsala

par Kai O. Pedersen

Comprehensive Biochemistry, vol 35, Elsevier, 1983, 233 - 281

(Version partielle, sans références ; partie 2)

La PREMIERE ultracentrifugeuse

Page 239 - Le nom "ultra-centrifugeuse" (« ultracentrifuge ») apparaît pour la première (page 240) fois dans un rapport de laboratoire de Svedberg le 15 février 1924. Au début Svedberg eut un grand nombre de difficultés à cause des convections qui dérangeaient la sédimentation normale. En plaçant le rotor "spin" en atmosphère d'hydrogène, les convections disparaissaient. Avant les congés d'été, ils purent envoyer un manuscrit au "Journal of the American Chemical Society" : "The ultracentrifuge, a new instrument for the determination of the size and distribution of size of particle in amicroscopic colloids"[12].
Page 240 - Avec la première ultracentrifugeuse, ils purent faire sédimenter les plus petites particules d’orgasols d'or, et le rêve de Svedberg était que l'on puisse également faire sédimenter des particules plus petites telles les protéines. Selon les manuels de biochimie, l'albumine d'œuf devait avoir une masse moléculaire moyenne de 34000. Au moyen d’une méthode d'absorption de la lumière utilisant la lumière U.V., il devait être possible de suivre la sédimentation de n'importe quelle protéine. Svedberg était impatient d'essayer, et Nichols vint de Madison pour étudier dans le laboratoire de Svedberg. Les premières expériences furent décevantes, aucune sédimentation de l'albumine de l'oeuf ne pouvant être observée.
Page 240 - Environ à ce moment là, Svedberg fit la connaissance de Robin Fahreus (1888-1968) car Mme Svedberg et Mme Fahreus étaient d'anciennes amies. Fahreus était professeur assistant de pathologie à l'Institut Caroline (l'Ecole de médecine den Stockholm). Sa thèse sur "The suspension stability of the blood" servit à introduire une méthode bien connue de mesure de la vitesse de sédimentation des globules rouges. Il était très intéressé par les protéines, et à la fin de 1924, il vint à Uppsala pour travailler quelques mois avec Svedberg.

( … )

(page 243) Les turbines présentaient un problème spécial, mais cette difficulté fut surmontée, en partie grâce à l’habileté et à l'intérêt du premier mécanicien du laboratoire, Mr Ivar Eriksson (1888 - 1967). Il n'eut jamais confiance, au niveau des plans de la machine, dans la forme des entrées d'huile et des "turbines blades", et il commença à expérimenter les siens propres. Un matin il parla à Svedberg de son nouveau modèle (déjà fini et prêt à être introduit dans la centrifugeuse). Contre l'opinion sceptique de Svedberg, il la testa. Dès que les nouvelles parties furent installées, la vitesse augmenta beaucoup et finalement , le 7 avril 1926, une vitesse du rotor de 40000 rpm fut atteinte, correspondant à une force centrifuge de 100000 g dans la cellule. Il était évident que cela était dû au fait d'avoir suivi les idées d'Erickson.
Page 243 - Dans les débuts de 1920, les laboratoires de chimie dans les universités suédoises avaient rarement des ateliers de mécanique, ainsi que du personnel formé à la mécanique ; même des travaux pour de petites constructions devient être donnés à des boutiques de la ville. Pour le travail sur l'ultracentrifugeuse, cependant, il est très vite devenu nécessaire de disposer plus facilement, dans le laboratoire, de personnes ayant de telles compétences, en plus des possibilités existant dans des sociétés extérieures. Ivar Eriksson, qui avait un emploi dans une fabrique de bicyclettes à Uppsala, aidait Svedberg pendant ses heures de liberté. Cependant, un jour de 1924, Svedberg fut étonné de le voir au laboratoire alors qu'on était le matin. Eriksson dit ensuite à Svedberg qu'il avait abandonné son emploi à l'usine pour travailler à plein temps sur la centrifugeuse. Il pensait que Svedberg avait besoin de lui. Quand Svedberg, qui n'avait pas été prévenu à l'avance, s'inquiéta de son salaire, Eriksson calmement répondit que les choses s'arrangeraient toutes seules, ce qui se révéla exact par la suite.
Page 243 - En plus de s’occuper des plans et de l’installation de la nouvelle ultracentrifugeuse haute vitesse, Svedberg était également engagé dans les aspects plus théoriques des méthodes de vitesse de sédimentation et d'équilibre de sédimentation. Dans le Zsigmondy Festschrift [13], il publia d'abord la célèbre formule de Svedberg

M = (R T S)/(D(1 - V. r)

pour le calcul du poids moléculaire en combinant les mesures de sédimentation et de diffusion. Il montra également comment la charge pouvait influencer la sédimentation d'un électrolyte colloïdal, et comment la distribution des concentrations dans la cellule pouvait varier dans un système polydispersé.
Page 243 - Durant la première année, toutes les mesures de concentration dans la cellule tournante furent basées sur l'absorption de lumière. Cependant, dans la mesure où les substances comme les hydrates de carbone, n'avaient pas d'absorption lumineuse suffisante, il fallait une autre méthode pour mesurer les concentrations ou les gradients de concentration dans les cellules en mouvement. Parmi les notes de Svedberg de cette époque, il y a des pages (page 244) datées des 14 - 16 décembre 1925, où il se réfère à l'article de Wiener[14] et où il calcule la déflexion qu'un faisceau lumineux va présenter quand il passe à travers un gradient de concentration dans une cellule de centrifugation. Il indique également l'équation pour calculer le poids moléculaire à partir de la déflexion en partant de certaines distances de l'axe de rotation à l'équilibre.
Page 244 - Le problème semble avoir été laissé de côté jusqu'à ce que Tiselius propose de photographier une échelle à travers la cellule en rotation ce qui rendait l'application de la méthode de Wiener encore plus adéquate. Le problème complet de l'introduction de la méthode de l'échelle et son arrière fond théorique fut mené à bien par Ole Lamm (1902 - 1964) quand il vint travailler avec Svedberg en 1927[15] [16] [17]
Page 244 - L'année porécédente Svedberg et Fähreus avaient envoyé leur article sur le poids moléculaire de l'hémoglobine au "Journal of the american Chemical Society". G.S. Adair (1896 - 1979) à Cambridge avait trouvé un poids moléculaire moyen de 66700 pour l'hémoglobine de dix espèces différentes[18] en utilisant une méthode optique améliorée. Svedberg et Fähreus n'ont été au courant de ce travail que peu de temps avant que leur article ait été publié.

( … )

Arne Tiselius

Page 250 - Arne Wilhelm Kaurin Tiselius était né à Stockholm le 10 Août 1902, le fils de Hans Abraham Jason Tiselius et de Rosa Kaurin, une fille du recteur d'une paroisse de montagne dans le centre de la Norvège.
Page 250 - La plupart des ancêtres des deux côtés étaient des érudits ("scholars") et beaucoup ont montré un grand intérêt pour la science, spécialement la biologie. Son père avait obtenu une licence en mathématiques à l'Université d'Uppsala
Page 250 - Son père mourut dès 1906, et sa mère déménagea avec Arne et (page 251) sa sœur pour Göteborg où vivaient ses grands-parents et où la famille avait des amis proches.
Page 251 - Le profond intérêt d'Arne Tiselius pour la science fut déjà éveillé dès l'école primaire à Göteborg, où il eut un maître de physique et de chimie inspiré qui découvrit ses capacités en chimie. Il lui donna une clé personnelle du laboratoire de l'école pour lui permettre de mener à bien ses propres travaux de chimie l'après midi après ses cours normaux. Graduellement, il lui devint clair qu'il voulait étudier à Uppsala avec Svedberg. En septembre 1921, il entra dans cette université à laquelle il allait être associé tout le reste de sa vie. En Mai 1924, il obtint son Master of Arts en chimie, physique et mathématiques.
Page 251 - Svedberg était intéressé depuis plusieurs années par l'étude de l'électrophorèse des protéines. les premières publications eurent lieu en 1923 et 1924. Pendant l'été 1925, Tiselius vint chez Svedberg comme assistant de recherche, et après un an ils publièrent un article sur l'usage de la méthode par absorption de la lumière pour suivre l’électrophorèse des protéines[19].
Page 251 - Svedberg était à ce moment très pris dans le développement de son ultracentrifugeuse haute vitesse à turbine d'huile et dans son utilisation pour l'étude des protéines, si bien qu'il laissa les problèmes d’électrophorèse entièrement à Tiselius à qui il fut laissé carte blanche, et comme dit Tiselius dans une sorte d'autobiographie[20] :

"... l’électrophorèse apparaissait tellement plus simple d'un point de vue technique, adaptée ("suitable") à un jeune homme pour jouer plus ou moins tout seul. Cependant, l'excellent atelier instrumental facilita grandement l'essai de nouvelles idées."

Svedberg et Tiselius 3

2010-04-17T09:50:37Z

The Svedberg et Arne Tiselius :
Les premiers développements de la chimie moderne des protéines à Uppsala

par Kai O. Pedersen

Comprehensive Biochemistry, vol 35, Elsevier, 1983, 233 - 281

(Version partielle, sans références ; partie 3)

Page 251 - Tiselius fit une étude très minutieuse des diverses sources d'erreurs dans la technique d’électrophorèse et de la manière de les contrôler. L’intensité de courant limite, aboutissant à une migration sans convection, fut établie à partir d’expériences avec des courants alternatifs. Des électrodes réversibles, argent - chlorure d'argent, remplacèrent les anciennes. Les volumes des réservoirs des électrodes furent calculés d'après des considérations théoriques. Les conditions optiques et photographiques furent redéfinies, une échelle de concentration pour l'absorption de la lumière fut établie à l'aide d'enregistrements microphotographiques et une justification théorique ajoutée pour l'utilisation du point correspondant à 50 % de concentration comme définissant la véritable position de la frontière. Plusieurs types d'anomalies de frontières furent discutés. Finalement, les comportements électrophorétiques de quelques protéines bien définies, comme l'albumine de l'œuf, la sérumalbumine et la phycoérythrine ont été déterminés. Dans des mélanges de telles protéines uniformes, les composants se révélèrent migrer indépendamment (page 252 : photo de Tiselius ; page 253) les uns des autres. Les préparations de globines de cheval fractionnées par les sels montrèrent une migration non homogène, mais aucun point d'inflexion défini ne fut détectable sur les courbes d'enregistrement photographique.
page 253 - En 1930, Tiselius soutint une thèse pour le grade de docteur es sciences à l'Université d'Uppsala. Dans celle-ci, il décrivit les résultats de ses études théoriques et expérimentales étendues sur la méthode utilisant le mouvement de la frontière pour l'étude de l'électrophorèse de protéines (Ref 33 : TISELIUS, A., Nova Acta R. Soc. Scient. Upsal. (4), 7 1930, N° 4, 1 - 107).

( … )

Chromatographie des substances incolores

Page 273 - Peu de temps après son engagement comme professeur de biochimie, Tiselius commença à élargir le champ de ses centres d’intérêt de recherche. Il avait souhaité que sa nouvelle technique d’électrophorèse puisse être également utile pour l’élucidation d’un problème de grand intérêt pour lui, à savoir l’isolement et l’identification de grands fragments et de polypeptides obtenus par dégradation douce de molécules protéiques. De ce point de vue, la nouvelle électrophorèse fut décevante ; il trouva qu’elle n’était pas suffisamment spécifique pour séparer la multitude des substances se rencontrant dans la matériel d’origine biologique. Il s’intéressa ensuite aux méthodes d’adsorption qui avaient été utilisées dans les préparations organiques et biochimiques. La séparation avait jusque là été étudiée essentiellement sur colonne après la conclusion de l’expérience. Tiselius vit la possibilité de développer une nouvelle méthode analytique quantitative dans laquelle la séparation dans l’éluat sortant de la colonne pouvait être observée par des méthodes réfractométriques similaires à celles utilisées en électrophorèse. Il donna également un traitement théorique qui reliait le volume de rétention d’une substance adsorbée à son coefficient d’adsorption et la masse d’adsorbant dans la colonne. Il considéra la modification du comportement d’adsorption se produisant du fait de la présence d’un second adsorbant plus fortement adsorbé[21] [22]
Page 273 - Toutes les premières expériences furent réalisées par analyse frontale qui permettait une détermination de la concentration des constituants dans un mélange, mais ne permettait pas leur séparation. Cette dernière fut réalisée en utilisant une méthode par élution. Les composants élués, cependant, montraient une traînée (« queue ») importante. En 1943, Tiselius montra que cela pouvait être évité par addition à la solution d’élution d’une substance ayant une plus grande affinité d’élution que tous les constituants du mélange. Cette méthode a depuis été appelée analyse par déplacement[23].
Page 273 - Les volumes de rétention spécifiques furent déterminés pour un grand nombre d’acide aminés et de peptides, et il fut trouvé que la longueur de la chaîne carbonée avait une influence décisive, chaque groupe -CH₂- produisant une augmentation donnée. Les volumes de rétention des acides aminés neutres restaient stables pour une vaste domaine de pH, alors que ceux des acide aminés acides et basiques montraient une importante dépendance du pH.
page 273 - Une amélioration technique importante fut réalisée par Tiselius et Claesson[24] quand ils introduisirent les méthodes interférométriques pour mesurer la concentration de l’éluat. L’objet de ce développement était de limiter l’instabilité liée à la faible différence de densité entre des couches voisines de l’éluat en restreignant le mélange par convection aux (page 274) très faibles volumes. Le volume du canal interféromérique était seulement 0,13 ml, et cet appareil fonctionnait thermostaté. En plus, un collecteur de fraction manuel était présent pour collecter les fractions d’effluent. L’équipement peut être vu comme l’ancêtre des montages automatisés actuels de chromatographie d’analyse et de fractionnement. Ce dispositif expérimental était exceptionnellement bien adapté à une étude détaillée des processus fondamentaux sous-tendant l’analyse chromatographique et son utilisation aboutit à des avancées théoriques et à leur vérification expérimentale.
page 274 - Les distinctions furent faites entre analyse frontale, élution et déplacement. Dans l’analyse frontale une solution est appliquée en continu sur une colonne d’adsorbant, et à cause de la différence des volumes de rétention se développe une série de gradients de concentration correspondant aux différents solutés séquentiellement ressemblant à la situation dans l’électrophorèse à frontière mobile. Avec cette procédure la séparation complète des composants dans un mélange n’est pas possible, mais seulement leur identification et leur estimation.

( … )

Page 278 - Graduellement, Tiselius s’intéressa de plus en plus à la surveillance des oiseaux et à leur photographie dans leur environnement naturel. Au printemps, il faisait de longues excursions la nuit avec son fils, Per, à quelques distances d’Uppsala, où il lui serait possible d’observer le comportement de cour des grands tétras (« capercailzie ») et d’écouter les plaintes (« crooning ») du coq de bruyère (« blackcock ») (P. Tiselius [25] ). A d’autres moments de l’année Tiselius et ses amis faisaient beaucoup d’excursions pour surveiller et photographier des oiseaux. Cet intérêt de Tiselius aboutit en Juin 1961 à la formation d'une petite « académie privée », la « Bäckhammar Academy od Sciences » qui consistait en un groupe de ses amis qui avaient un intérêt commun en ornithologie. L’académie incluait cinq membres et leurs femmes. Tiselius était le président ; le vice président était le Dr Victor Hasselblad, le constructeur de la camera Hasselblad bien connue. L’académie se réunissait environ dix jours par an, normalement durant le printemps au manoir de Jonsbol, appartenant au Dr Hasselblad et (once part) de l’état de Bäckhammar. De Jonsbol ils firent des excursions à des endroits variés de Värmland pour étudier et photographier la vie très riche des oiseaux dans cette partie de la Suède.
Page 278 - L’impression la plus fine de la personnalité aux multiples talents de Tiselius peut être obtenue en étudiant son article de 1968 « Réflexions des deux côtés de la barrière »[26].
Page 278 - Arne Tiselius mourut le 29 Octobre 1971, et il est enterré au cimetière d’Uppsala, pas très loin de sa maison.
(page 279) - Une biographie de la vie de Tiselius ainsi qu’une bibliographie de ses différentes publications peuvent être trouvées dans les Biographical Memoirs of the Fellows of the Royal Society[27]

En retrospective,

Page 279 - En regardant en arrière le développement de la chimie des protéines durant les 50 - 60 dernières années, on peut trouver que beaucoup de progrès ont été réalisés grâce à l’utilisation des méthodes physico-chimiques. L’introduction par Svedberg de l’ultracentrifugeuse aboutit à la découverte que les protéines sont des substances chimiques bien définies, ayant des poids moléculaires bien définis. La vitesse de sédimentation en ultracentrifugation, et plus tard la technique d’électrophorèse selon Tiselius , rendit possible dans beaucoup de cas de visualiser d’une manière beaucoup plus directe le degré d’efficacité de l’isolement et de la purification d'une protéine donnée. Cela amena Svedberg à avancer son hypothèse du système multiple des poids moléculaires des protéines. Et bien que cette théorie ne soit pas d’une nature aussi générale que Svedberg l’avait supposé au début, cela a une grande influence sur le développement de la chimie des protéines, spécialement dans les années 30 et au début des années 40. Cela initia un intérêt nouveau et plus important pour ces groupes de substances. Plusieurs chimistes et physiciens découvrirent que les protéines ne doivent pas plus longtemps être considérées comme des colloïdes indéfinis, mais étaient bien définis, (à savoir comme) des substances excessivement intéressantes et importantes, (à savoir) des substances bien intéressantes à étudier.
Page 279 - Une des premières étapes avait été franchie dans la nouvelle science de la biologie moléculaire Cependant, plusieurs étapes supplémentaires devaient être franchies avant que les problèmes en relation avec la composition chimique détaillée et la structure des protéines puissent être abordés.
Page 279 - De telles étapes nouvelles furent introduites dans les années 40 et les décades suivantes par Tiselius et ses collaborateurs. Ils développèrent et introduisirent dans la chimie des protéines nombre de nouvelles méthodes de séparation et de fractionnement, plus spécifiques